BCA和WB
western blot如何定量测定细胞中某蛋白表达量? -
Western blot（蛋白质印迹法）通常用于定性分析蛋白质的存在以及研究它们在不同条件下的表达变化。其大致步骤如下：1.样品制备：使用合适的裂解缓冲液将细胞裂解，并使用蛋白质浓度测定方法（例如BCA或Bradford法）测定蛋白质总浓度。2.SDS-PAGE:根据预期的蛋白大小选择适当的凝胶，并加载相同量的总蛋白至各等我继续说。
保证每个样蛋白总量一致～这样目的条带含量的变化才有说服力～
Western blot（蛋白质印迹法）通常用于定性分析蛋白质的存在以及研究它们在不同条件下的表达变化。其大致步骤如下：1.样品制备：使用合适的裂解缓冲液将细胞裂解，并使用蛋白质浓度测定方法（例如BCA或Bradford法）测定蛋白质总浓度。2.SDS-PAGE:根据预期的蛋白大小选择适当的凝胶，并加载相同量的总蛋白至各等我继续说。
保证每个样蛋白总量一致～这样目的条带含量的变化才有说服力～
那很有可能是定量的时候不准，建议你根据内参条带的亮度调整上样量，保证内参一致的情况下再看目的条带的变化，
区分不了，除非有分子测定仪可以测定出分子质量和构成来确定哪种蛋白是哪种蛋白，否则的话只能重新做一份了，下次一定注意把WB蛋白的区别放置，当进行接触滤纸、凝胶和膜的操作时，应戴手套。手上的油脂会阻断转移，提蛋白一定要过硬，不能吝惜蛋白酶抑制剂，测定蛋白浓度一定要选好方法，最重要的，wb的好了吧！
请问生化难吗?该怎么学?? -
功能，氨基酸的种类，基因方面同样是结构和功能。如果你是生物相关专业的，那我想深入的学习这门课程对你是有很大的帮助的，因为那必定是你的一门专业课，你不仅要掌握理论知识，像PCR、SDS-PAGE、WB、BCA等等都是很重要的实验技术，总之根据你的需要好好去学吧，学到手都是自己的！
我采用的是***公司的BCA蛋白定量试剂盒测定提取蛋白浓度，和说明书protocol差别不大，稍有不同，如下： 1.稀释BSA标准品以制作标准曲线：取7支EP管，每管加30ul生理盐水，第一管加30ulBSA,混匀后再取30ul至第二管，依次倍比稀释，最后一管不加为空白(即本底值)。则8个标准品的浓度分别为2ug/ul、1ug/ul、0.5希望你能满意。
western blot的内参总是做不好。。。老是条带不一致 -
1，如果是组织样品确实不好做，可以先用0.45滤膜过滤一下2，可以第一次做的时候多准备些煮好的样品，上样用一部分，其它冻-20，出来结果后根据结果再调整下一次上样的多少，这样不用重新冻融原来的样品，因为没煮过的样品冻融再测浓度会因为一些蛋白降解和沉淀的问题导致和上次成分不一样，3，..
Western-blot是一种半定量的检测手段。个人认为如果要通过灰度值来计算蛋白浓度，那就是和内参来做对比，因为内参的浓度是已知且单一条带的蛋白样品。通过待测样品盒内参样品灰度值做对比可以算出待测样品大概的浓度。个人意见，仅供参考，因为一般检测蛋白含量的做法都是通过BF，BCA，Lowry之类的检测方法来有帮助请点赞。
内参配制方法 -
Bradford 法敏感度zui高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其zui主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在WB实验时使用内参，即可简便地对等会说。
1. 配制工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温下可保存24小时。2. 稀释标准品（BSA）：取10ul BSA标准品用PBS稀释至100ul（样品一般可用PBS稀释）。3. 取标准品和样品各20ul加入96孔板的孔中。4. 在各孔中加入20ul的还有呢？